Co to jest synteza peptydów

 

Synteza peptydów jest aktywną dziedziną chemii białek i peptydów, która zazwyczaj polega na sekwencyjnym dodawaniu aminokwasów w określonej kolejności w celu utworzenia łańcucha peptydowego metodami chemicznymi. Głównymi metodami syntezy są synteza w fazie ciekłej i fazie stałej. W porównaniu do LPPS, SPPS ma tę zaletę, że jest szybszy, prostszy, powoduje mniej reakcji ubocznych i wyższą wydajność.

 

Standardowa metoda SPPS, obejmująca strategie Boc (benzyl) i Fmoc (tBu).

 

 

Strategia Boc (benzyl).

W tym podejściu do syntezy jako stałe nośniki stosuje się chlorometylowane, hydroksymetylowane żywice polistyrenowe i p-metoksybenzylowe (PMA). Grupę -aminową zabezpiecza się t-butoksykarbonylem (Boc), natomiast grupy bocznych łańcuchów aminokwasów zabezpiecza się pochodnymi benzylowymi. Grupę Boc usuwa się za pomocą czystego TFA lub TFA w CH2Cl2, a na koniec syntezy grupy zabezpieczające łańcuchy boczne i wiązania peptyd-żywica usuwa się mocnym kwasem, takim jak bezwodny kwas fluorowodorowy (HF) lub TFMSA.

 

Strategia Fmoc (tBu).

W tym podejściu do syntezy jako stałe nośniki stosuje się żywicę Wanga, 2-Chlorotrityl Chloride Resin, Rink Amide-AM Resin, Rink Amide-MBHA żywice. Grupa -aminowa jest zabezpieczona 9-fluorenylometoksykarbonylem (Fmoc ), podczas gdy grupy łańcuchów bocznych aminokwasów są zabezpieczone grupami zabezpieczającymi nietrwałymi w środowisku kwasowym. Grupę Fmoc usuwa się za pomocą 20% piperydyny w DMF, a na koniec syntezy grupy zabezpieczające łańcuchy boczne i wiązania peptyd-żywica usuwa się za pomocą 1%-95% TFA. Obecnie preferowaną metodą syntezy peptydów jest Fmoc SPPS.

 

Podstawowe zasady syntezy peptydów w fazie stałej Fmoc

 

Wybierz żywicę

Najczęściej stosowane żywice w Fmoc SPPS, w tym żywica 4-alkohol alkoksybenzylowy (Wang), 2-żywica chlorku chlorotritylu, żywica Rink Amide Resin, żywice Rink Amide-MBHA. Żywice amidowe stosuje się do syntezy peptydów z wymaganym C-końcowym amidowaniem. Żywica Wanga i żywica 2-Cl Trt są powszechnie stosowane do syntezy peptydów z wymaganym wolnym C-końcem COOH. Jeśli jednak na końcu C peptydu jako pierwszy aminokwas znajdują się Pro i Gly, nie należy stosować żywicy Wang ze względu na ryzyko tworzenia się DKP (diketopiperazyny). Zaleca się stosowanie żywicy 2-Chlorotrityl Chloride Resin.

 

 

Przyłączanie chronionych aminokwasów do żywic

Pierwszy aminokwas Fmoc jest przyłączony do nierozpuszczalnej żywicy nośnikowej poprzez łącznik nietrwały w środowisku kwasowym.

 

Odbezpieczenie grupy zabezpieczającej -amino

Tymczasową grupę zabezpieczającą Fmoc na N-końcu peptydylożywicy usuwa się traktując ją 20% roztworem piperydyny w DMF. Reakcja ta zwykle kończy się w ciągu 10 do 20 minut.

 

Etapy mycia

Po każdej reakcji chemicznej przeprowadza się etapy przemywania w celu usunięcia z żywicy nadmiaru odczynników, produktów ubocznych i nieprzereagowanych cząsteczek. Pomaga to zachować czystość rosnącego łańcucha peptydowego.

 

Aktywacja i sprzęganie chronionego aminokwasu

Zabezpieczony aminokwas związany z żywicą jest aktywowany w celu zwiększenia jego reaktywności przy sprzęganiu z kolejnym aminokwasem w sekwencji. Typowe środki aktywujące obejmują HOAt, HOBt, PyBOP, PyAOP, HBTU i HATU. Sprzęganie obejmuje utworzenie wiązania peptydowego pomiędzy aktywowanym aminokwasem a grupą aminową rosnącego łańcucha peptydowego. Test Kaisera jest zwykle stosowany do monitorowania kompletności reakcji sprzęgania.

 

Etapy mycia

Podobnie jak w przypadku wcześniejszych etapów przemywania, zapewnia to usunięcie nadmiaru reagentów i produktów ubocznych po reakcji sprzęgania.

 

Odszczepienie od żywicy i odbezpieczenie grup zabezpieczających łańcuch boczny

Po zsyntetyzowaniu pożądanej sekwencji peptydowej na żywicy, oddziela się ją od stałego nośnika za pomocą koktajlu rozszczepiającego, takiego jak kwas trifluorooctowy (TFA), zawierającego zmiatacze, takie jak tioanizol i woda. Jednocześnie usuwane są grupy zabezpieczające łańcuchy boczne z reszt aminokwasowych, odsłaniając w pełni odblokowany peptyd gotowy do oczyszczania i analizy.