Hej! Jestem dostawcą komórek TET - 213, a dziś przejrzę cię, jak wykonywać barwienie immunofluorescencyjne na tych komórkach. Barwienie immunofluorescencyjne jest bardzo przydatną techniką w świecie biologii komórkowej. Pomaga nam wizualizować określone białka w komórkach, dając nam lepsze zrozumienie ich funkcji i lokalizacji.
Przygotowanie komórek TET - 213
Po pierwsze, musimy przygotować nasze komórki TET - 213. Zacznij od zwiększenia ich w odpowiednim medium hodowlanym. Komórki te zwykle radzą sobie dobrze w pożywce takiej jak RPMI 1640 uzupełniona 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% parecyliną - streptomycyną. Inkubuj komórki w 37 ° C w 5% atmosferze Co₂.
Gdy komórki osiągną około 70 - 80% konfluencji, nadszedł czas, aby rozpocząć proces barwienia. Musisz zaszczepić komórki na szkiełkach nakrywkowych w 24 -studzienkowym płycie. Ułatwia to obsługę komórek podczas schodów barwienia. Użyj pipety, aby ostrożnie przenieść zawieszenie komórki na szkiełki nakrywkowe. Pamiętaj, aby równomiernie rozpowszechniać komórki.
Naprawianie komórek
Po przyłączeniu komórek do szkiełek nakrywkowych (zwykle po 24 godzinach) nadszedł czas, aby je naprawić. Połączenie ma kluczowe znaczenie, ponieważ zachowuje strukturę komórki i utrzymuje białka na miejscu. Możesz użyć utrwalacza, takiego jak 4% paraformaldehydu (PFA) w soli fizjologicznej z buforowaną fosforanem (PBS). Dodaj wystarczającą ilość PFA, aby pokryć komórki na szkiełkach nakrywkowych i pozwól mu siedzieć w temperaturze pokojowej przez około 15–20 minut.
Po wykonaniu fiksacji umyj komórki trzy razy PBS. Każde mycie powinno trwać około 5 minut. Pomaga to usunąć nadmiar utrwalający z komórek.
Permeabilizacja
Następny jest permeabilizacja. Ten krok pozwala przeciwciałom wejść do komórek i wiązać się z białkami docelowymi. Użyj środka permeabilizującego, takiego jak 0,1% Triton X - 100 w PBS. Dodaj roztwór permeabilizujący do komórek i pozwól mu inkubować w temperaturze pokojowej przez około 10 minut.
Następnie ponownie umyj komórki trzykrotnie PBS, tak jak w poprzednim kroku. Zapewnia to, że agent permeabilizujący zostanie całkowicie usunięty.
Bloking
Blokowanie jest ważnym krokiem zapobiegającym nieokreślonym wiązaniu przeciwciał. W PBS możesz użyć rozwiązania blokującego, takiego jak 5% albumina surowicy bydlęcej (BSA). Dodaj roztwór blokujący do komórek i pozwól mu inkubować w temperaturze pokojowej przez około 1 godzinę.
Inkubacja przeciwciał pierwotnych
Teraz nadszedł czas, aby dodać pierwotne przeciwciało. Pierwotne przeciwciało jest specyficzne dla białka, które chcesz wykryć w komórkach TET - 213. Rozcieńcz pierwotne przeciwciało w roztworze blokującym zgodnie z instrukcjami producenta.
Ostrożnie usuń roztwór blokujący z komórek i dodaj rozcieńczone pierwotne przeciwciało. Pamiętaj, aby całkowicie pokryć komórki roztworem przeciwciała. Inkubuj komórki z pierwotnym przeciwciałem przez noc w 4 ° C. Ten długi czas inkubacji pozwala przeciwciałom skutecznie wiązać się z docelowym białkiem.
Następnego dnia umyj komórki trzy razy PBS, przy czym każde mycie trwa około 5 minut. Pozbywa się to niezwiązane z pierwotnym przeciwciałem.
Inkubacja przeciwciał wtórnych
Po pierwotnej inkubacji przeciwciał czas na wtórne przeciwciało. Drugorzędowe przeciwciało jest znakowane fluorescencyjnym barwnikiem, co pozwala nam wizualizować docelowe białko pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Rozcieńcz wtórne przeciwciało w roztworze blokującym zgodnie z instrukcjami producenta. Usuń PBS z komórek i dodaj rozcieńczone wtórne przeciwciało. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez około 1-2 godziny w ciemności. Ciemne środowisko jest ważne, aby zapobiec zanikaniu barwnika fluorescencyjnego.
Po zakończeniu inkubacji umyj komórki trzy razy PBS, tak jak wcześniej.
Kontrastowe
Staranie kontrastowe służy do wizualizacji jąder komórkowych. Możesz użyć barwnika takiego jak DAPI (4 ', 6 - diamidino - 2 - fenyloindol). Rozcieńcz DAPI w PBS i dodaj go do komórek. Pozwól inkubować w temperaturze pokojowej przez około 5 minut.
Następnie umyj komórki ponownie PBS, aby usunąć nadmiar DAPI.
Montowanie
Wreszcie nadszedł czas, aby zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych. Użyj pożywki montażowej, która pomaga utrzymać komórki na miejscu, a także zachowuje fluorescencję. Ostrożnie umieść kroplę podłoża montażowego na szkiełku mikroskopowym, a następnie odwróć szkiełkę nakrywkową na kroplę. Upewnij się, że między szkiełką nakrywkową a szkiełkiem nie ma żadnych pęcherzyków powietrza.
Obrazowanie
Teraz jesteś gotowy do wyobrażenia komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym. Użyj odpowiednich filtrów, aby wizualizować sygnały fluorescencyjne z wtórnego przeciwciała i DAPI. Możesz zrobić wiele zdjęć na różnych dziedzinach widzenia, aby uzyskać dobrą reprezentację komórek.
Używanie powiązanych peptydów w tym procesie
Podczas hodowli komórkowej i procesu barwienia możesz również uznać, że niektóre peptydy są przydatne. Na przykład,(GLY14) -Humanina (ludzka)Wykazano, że ma pewny wpływ na żywotność i funkcję komórek. Możesz dodać go do pożywki hodowlanej, aby zobaczyć, czy wpływa to na ekspresję białka, które badasz w komórkach TET - 213.
Peptyd fibronektyny CS1może być użyte do pokrycia szkiełek nakrywkowych przed wysianiem komórek. Może to poprawić przywiązanie i rozprzestrzenianie się komórek, dzięki czemu proces barwienia jest bardziej wydajny.
Endotelina - 1 (11 - 21)może również odgrywać rolę w szlakach sygnałowych w komórkach TET - 213. Możesz dodać go do pożywki hodowlanej, a następnie zbadać, w jaki sposób wpływa ono na ekspresję białka docelowego poprzez barwienie immunofluorescencji.
Wniosek
Wykonanie barwienia immunofluorescencji na komórkach TET - 213 może być nieco trudnym procesem, ale jeśli postępujesz dokładnie zgodnie z tymi krokami, powinieneś być w stanie uzyskać świetne wyniki. Jest to potężna technika, która może zapewnić cenne wgląd w biologię tych komórek.
Jeśli chcesz kupić TET - 213 komórek lub którykolwiek z powiązanych peptydów wymienionych na tym blogu, skontaktuj się z nami, aby uzyskać więcej informacji i rozpocząć dyskusję na temat zamówień. Jesteśmy tutaj, aby pomóc Ci we wszystkich twoich potrzebach biologii komórkowej.
Odniesienia
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., i Walter, P. (2002). Biologia molekularna komórki. Garland Science.
- Pollard, TD i Earnshaw, WC (2004). Biologia komórkowa. Saunders.