Transfekcja jest kluczową techniką w biologii molekularnej, która umożliwia wprowadzenie obcych kwasów nukleinowych do komórek, umożliwiając badaczom badanie funkcji genów, ekspresji białka i szlaków sygnałowych komórkowych. Komórki TET-213, ludzka linia komórkowa neuroblastoma, są powszechnie stosowane w badaniach neuronauki ze względu na ich właściwości neuronalne. W tym poście na blogu podzielę się pewnymi spostrzeżeniami, jak skutecznie transfekować komórki TET-213, opierając się na moim doświadczeniu jako dostawcy komórek TET-213.
Zrozumienie komórek TET-213
Przed zagłębieniem się w proces transfekcji ważne jest, aby zrozumieć cechy komórek Tet-213. Komórki te pochodzą z ludzkiego neuroblastaka i wykazują cechy neuronalne, takie jak zdolność rozszerzania neurytów i wyrażania markerów neuronalnych. Są to przylegające komórki, które dobrze rosną w standardowych warunkach hodowli komórkowej, zwykle w pożywce uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykami.
Wybór właściwej metody transfekcji
Dostępnych jest kilka metod transfekcji komórek, każda z własnymi zaletami i ograniczeniami. Wybór metody transfekcji zależy od różnych czynników, w tym rodzaju transfekcji kwasu nukleinowego, typu komórek i pożądanej wydajności transfekcji. Oto niektóre typowe metody transfekcji odpowiednie dla komórek TET-213:
Transfekcja na bazie lipidów
Transfekcja na bazie lipidów jest jedną z najczęściej stosowanych metod wprowadzania kwasów nukleinowych do komórek. Obejmuje stosowanie odczynników na bazie lipidów, które tworzą kompleksy z kwasem nukleinowym, które są następnie pobierane przez komórki przez endocytozę. Transfekcja na bazie lipidów jest stosunkowo łatwa w wykonaniu i może osiągnąć wysoką wydajność transfekcji w wielu typach komórek, w tym w komórkach TET-213.
Elektroporacja
Elektroporacja jest fizyczną metodą, która wykorzystuje pole elektryczne do tworzenia tymczasowych porów w błonie komórkowej, umożliwiając wchodzenie do kwasu nukleinowego. Ta metoda jest szczególnie przydatna do transfekcji komórek, które są trudne do transfekcji przy użyciu innych metod, takich jak komórki pierwotne. Jednak elektroporacja może być bardziej szkodliwa dla komórek i może wymagać optymalizacji parametrów elektroporacji w celu uzyskania wysokiej wydajności transfekcji.
Transdukcja wirusa
Transdukcja wirusowa obejmuje stosowanie wektorów wirusowych do dostarczania kwasu nukleinowego do komórek. Wektory wirusowe pochodzą z wirusów, które zostały zaprojektowane w celu przenoszenia pożądanego kwasu nukleinowego i mogą skutecznie infekować komórki. Transdukcja wirusowa może osiągnąć wysoką wydajność transfekcji i może być stosowana do transfekcji szerokiego zakresu typów komórek, w tym komórek TET-213. Jednak transdukcja wirusowa wymaga specjalistycznego sprzętu i wiedzy specjalistycznej oraz istnieją potencjalne obawy dotyczące bezpieczeństwa związane z stosowaniem wektorów wirusowych.
Przygotowanie komórek do transfekcji
Właściwe przygotowanie komórek jest niezbędne do pomyślnej transfekcji. Oto kilka kroków do wykonania przy przygotowaniu komórek TET-213 do transfekcji:
Hodowla komórkowa
Utrzymuj komórki TET-213 w odpowiedniej pożywce hodowlanej komórkowej uzupełnionej FBS i antybiotykami. Chodźmy regularnie komórki, aby utrzymać wykładniczą fazę wzrostu. Ważne jest, aby stosować zdrowe, aktywnie rosnące komórki do transfekcji, ponieważ komórki w złym stanie fizjologicznym mogą mieć niższą wydajność transfekcji.
Siew komórki
Zadzwonić komórki Tet-213 w szalce hodowlanej lub płycie wielobornej z odpowiednią gęstością. Gęstość siewu zależy od metody transfekcji i rodzaju eksperymentu. W przypadku transfekcji na bazie lipidów zazwyczaj zaleca się gęstość siewu 50–80% konfluencji.
Inkubacja komórkowa
Inkubuj posiewane komórki w nawilżonym inkubatorze w 37 ° C z 5% CO2 przez co najmniej 24 godziny przed transfekcją, aby umożliwić komórkom przyczepianie i powrót do zdrowia po procesie siewu.
Wykonanie transfekcji
Po przygotowaniu komórek nadszedł czas, aby przeprowadzić transfekcję. Oto ogólny protokół transfekcji komórek TET-213 na bazie lipidów:
Przygotuj odczynnik transfekcji
Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby przygotować odczynnik transfekcji na bazie lipidów. Zazwyczaj obejmuje to rozcieńczenie odczynnika w odpowiednim pożywce transfekcyjnej.
Przygotuj kwas nukleinowy
Przygotuj kwas nukleinowy do transfekcji, taki jak plazmid DNA lub siRNA. Rozcieńcz kwas nukleinowy w odpowiedniej pożywce transfekcyjnej.
Tworzyć kompleks transfekcji
Wymieszaj rozcieńczony odczynnik transfekcji i rozcieńczony kwas nukleinowy w rurce i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut, aby umożliwić powstawanie kompleksu transfekcyjnego.
Dodaj kompleks transfekcji do komórek
Usuń pożywkę hodowlaną z komórek i zastąp ją świeżą pożywką transfekcyjną. Dodaj kompleks transfekcji do komórek, pod względem upuszczania i delikatnie wiruj płytkę, aby równomiernie rozłożyć kompleks.
Inkubuj komórki
Inkubuj transfekowane komórki w nawilżonym inkubatorze w 37 ° C z 5% CO2 przez odpowiedni czas, w zależności od rodzaju kwasu nukleinowego i eksperymentu. W przypadku transfekcji plazmidowej DNA czas inkubacji wynoszący 24-48 godzin jest zwykle wystarczający, aby umożliwić ekspresję genów.
Ocena wydajności transfekcji
Po transfekcji ważne jest, aby ocenić wydajność transfekcji, aby ustalić, czy transfekcja się powiodła. Dostępnych jest kilka metod oceny wydajności transfekcji, w tym:
Mikroskopia fluorescencyjna
Jeśli transfekowany kwas nukleinowy koduje białko fluorescencyjne, takie jak GFP, mikroskopia fluorescencyjna może być stosowana do wizualizacji transfekowanych komórek. Odsetek komórek fluorescencyjnych można zastosować jako oszacowanie wydajności transfekcji.
Cytometria przepływowa
Cytometrię przepływową można zastosować do kwantyfikacji procentu transfekowanych komórek na podstawie ekspresji markera fluorescencyjnego lub antygenu powierzchniowego komórkowego. Ta metoda zapewnia dokładniejszą i ilościową miarę wydajności transfekcji w porównaniu z mikroskopią fluorescencyjną.
Western blotting lub QPCR
Jeśli transfekowany kwas nukleinowy koduje białko będące przedmiotem zainteresowania, można zastosować Western blotting lub QPCR do wykrycia ekspresji białka odpowiednio na poziomie białka lub mRNA. Ta metoda może dostarczyć informacji o poziomie ekspresji genów i funkcjonalności transfekowanego białka.
Rozwiązywanie problemów typowych problemów z transfekcją
Transfekcja może czasem być trudna i istnieje kilka typowych problemów, które mogą wystąpić. Oto kilka wskazówek związanych z rozwiązywaniem problemów z powszechnymi problemami z transfekcją:
Niska wydajność transfekcji
- Sprawdź jakość i ilość kwasu nukleinowego. Upewnij się, że kwas nukleinowy jest czysty i jest wysokiej jakości.
- Zoptymalizuj warunki transfekcji, takie jak stężenie odczynnika transfekcji, stosunek kwasu nukleinowego do reagenta i czas inkubacji.
- Sprawdź zdrowie i żywotność komórek. Upewnij się, że komórki są zdrowe i aktywnie rosną przed transfekcją.
- Wypróbuj inną metodę transfekcji lub odczynnika.
Toksyczność komórkowa
- Zmniejsz stężenie odczynnika transfekcyjnego lub kwasu nukleinowego.
- Zoptymalizuj warunki transfekcji, aby zminimalizować uszkodzenie komórek.
- Użyj innej metody transfekcji lub odczynnika, która jest mniej toksyczna dla komórek.
Skuteczność transfekcji zmiennej
- Upewnij się, że komórki są równomiernie zaszczepione i przy odpowiedniej gęstości.
- Dokładnie wymieszaj kompleks transfekcji przed dodaniem go do komórek.
- Inkubuj komórki w spójnych warunkach, aby zminimalizować zmienność.
Wniosek
Transfekowanie komórek TET-213 może być trudnym, ale satysfakcjonującym procesem. Wybierając odpowiednią metodę transfekcji, prawidłowo przygotowując komórki i postępując zgodnie z odpowiednim protokołem, możesz osiągnąć wysoką wydajność transfekcji i uzyskać wiarygodne wyniki. Jeśli masz jakieś pytania lub potrzebujesz dalszej pomocy w transfekcji komórek TET-213, nie wahaj się z nami skontaktować. Jesteśmy wiodącym dostawcą komórek TET-213 i możemy zapewnić wysokiej jakości komórki, odczynniki transfekcyjne i wsparcie techniczne.
Oprócz komórek Tet-213 oferujemy również szeroki zakres peptydów, w tymGalanan (człowiek)WCyclo (RGDFC), IDynorfina A (1-13), amid, świńska. Te peptydy mogą być stosowane w różnych zastosowaniach badawczych, takich jak neuronauka, badania nad rakiem i odkrywanie leków.
Jeśli chcesz kupić komórki TET-213 lub którykolwiek z naszych peptydów, skontaktuj się z nami, aby omówić swoje konkretne potrzeby. Z niecierpliwością czekamy na współpracę z Tobą i pomóc w osiągnięciu celów badawczych.
Odniesienia
- Sambrook, J., i Russell, DW (2001). Klonowanie molekularne: podręcznik laboratoryjny. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Ausubel, FM, Brent, R., Kingston, RE, Moore, DD, Seidman, JG, Smith, JA, i Struhl, K. (red.). (2002). Obecne protokoły w biologii molekularnej. John Wiley & Sons.
- Chen, C. i Okayama, H. (1987). Wysokiej wydajności transformacja komórek ssaków przez plazmid DNA. Biologia molekularna i komórkowa, 7 (8), 2745-2752.
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., i Hofschneider, Ph (1982). Przeniesienie genów do mysich ogniw lioma przez elektroporację w polach o wysokiej elektrycznej. Embo Journal, 1 (7), 841-845.
- Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, FH, ... i Verma, IM (1996). Dostarczanie genów in vivo i stabilna transdukcja komórek niewidialnych przez wektor lentiwirusowy. Science, 272 (5259), 263-267.