W dziedzinie badań i rozwoju peptydów czystość peptydów katalogowych ma ogromne znaczenie. Jako dedykowany dostawca peptydów katalogowych rozumiemy znaczenie dostarczania produktów wysokiej jakości naszym klientom. Czasami, pomimo naszych najlepszych wysiłków w początkowej syntezie i procesach oczyszczania, może istnieć potrzeba dalszego oczyszczania peptydów katalogowych. Na tym blogu zbadamy różne metody i rozważania dotyczące dalszego oczyszczania peptydów katalogowych w razie potrzeby.
Dlaczego dalsze oczyszczenie?
Istnieje kilka powodów, dla których konieczne może być dalsze oczyszczanie peptydów katalogowych. Po pierwsze, w bardzo wrażliwych zastosowaniach badawczych, takich jak testy komórkowe, badania in vivo lub badania biologii strukturalnej, nawet śladowe ilości zanieczyszczeń mogą mieć znaczący wpływ na wyniki eksperymentalne. Zanieczyszczenia mogą potencjalnie zakłócać biologiczną aktywność peptydu, prowadząc do fałszywych pozytywów lub negatywów.
Po drugie, wymagania regulacyjne w niektórych branżach, takich jak farmaceutyki, wymagają bardzo wysokiego poziomu czystości peptydów stosowanych w opracowywaniu leków. Jeśli peptyd jest uważany za potencjalny środek terapeutyczny, wszelkie zanieczyszczenia mogą stanowić ryzyko dla bezpieczeństwa pacjentów, a zatem niezbędne są dodatkowe etapy oczyszczania.
Metody chromatograficzne
Odwrócona - fazowa chromatografia cieczowa o wysokiej wydajności (RP - HPLC)
RP - HPLC jest jedną z najczęściej stosowanych metod oczyszczania peptydów. Oddziela peptydy na podstawie ich hydrofobowości. Faza stacjonarna w RP - HPLC jest materiałem hydrofobowym, zazwyczaj kolumną na bazie krzemionki z dołączonymi łańcuchami alkilowymi (np. C18 lub C8). Peptydy o różnych hydrofobowościach będą oddziaływać inaczej z fazą stacjonarną, co spowoduje różne czasy retencji.
Aby dalej oczyszczać peptydy katalogowe za pomocą RP - HPLC, najpierw musimy wybrać odpowiednią fazę ruchomą. Wspólna faza mobilna składa się z mieszaniny wody i organicznego rozpuszczalnika, takiego jak acetonitryl lub metanol, z dodaniem niewielkiej ilości kwasu (np. Kwas trifluorooctowego, TFA) w celu poprawy szczytowej kształtu. Dostosowując gradient rozpuszczalnika organicznego, możemy zoptymalizować oddzielenie docelowego peptydu od zanieczyszczeń.
Na przykład, jeśli mamy peptyd katalogowy jakLL-37, peptyd przeciwdrobnoustrojowy, który jest peptydem przeciwdrobnoustrojowym z potencjalnymi zastosowaniami terapeutycznymi, RP - HPLC może być stosowany do usunięcia pozostałej syntezy przez - produkty lub zdegradowane fragmenty. Oczyszczone LL - 37 można następnie zastosować w dokładniejszych testach aktywności przeciwdrobnoustrojowej.
Ion - Chromatografia Exchange
Chromatografia wymiany wymiany oddziela peptydy na podstawie ich ładunku. Istnieją dwa główne typy: kation - chromatografia wymiany (CEX) i anion - chromatografia wymiany (AEX). W CEX faza stacjonarna ma ujemnie naładowaną grupę, a peptydy z netto ładunkiem dodatnim z nią powiązają. W AEX faza stacjonarna jest dodatnio naładowana i zostaną zachowane ujemnie naładowane peptydy.
Wybór między CEX i AEX zależy od punktu izoelektrycznego (PI) peptydu. Jeśli PI peptydu znajduje się poniżej pH fazy ruchomej, peptyd będzie miał ładunek ujemny netto i można zastosować AEX. I odwrotnie, jeśli PI jest powyżej pH fazy ruchomej, CEX jest bardziej odpowiedni.
Na przykład,Ureistachykinin II, peptyd o określonym profilu ładunku, można dalej oczyszczać przy użyciu chromatografii jonowej - wymiany. Starannie wybierając mobilne pH fazy i siłę jonową, możemy osiągnąć dobry oddzielenie docelowego peptydu od innych naładowanych zanieczyszczeń.
Metody elektroforetyczne
Dodecylulfinian sodu - elektroforeza żelowa poliakryloamidowa (SDS - strona)
Chociaż SDS - strona jest wykorzystywana głównie do analizy białek, w pewnym stopniu można ją również zastosować do oczyszczania peptydu. Na stronie SDS peptydy są denaturowane przez SDS i oddzielone na podstawie ich masy cząsteczkowej. Peptydy migrują przez żel poliakryloamidowy pod wpływem pola elektrycznego.
Po elektroforezie żel można zabarwić w celu wizualizacji peptydów. Pasmo odpowiadające docelowe peptyd można następnie wyciąć z żelu, a peptyd można elurować z matrycy żelowej. Jednak ta metoda ma pewne ograniczenia. Proces elucji może być złożony i może wystąpić utrata peptydu podczas oczyszczania. Ponadto SD może być trudne do całkowitego usunięcia z oczyszczonego peptydu.
Elektroforeza naczyń włosowatych (CE)
Elektroforeza naczyń włosowatych jest potężną techniką separacji peptydów. Oferuje wysoką wydajność separacji, krótki czas analizy i niskie zużycie próbek. CE oddziela peptydy na podstawie ich ładunku - do - wskaźnika masy. Istnieją różne tryby CE, takie jak elektroforeza strefy kapilarnej (CZE), elektroforeza żelowa kapilarna (CGE) i chromatografia elektrokinetyczna elektrokinetyczna (MEKC).
CZE jest najczęściej stosowanym trybem do analizy i oczyszczania peptydu. W CZe peptydy są rozdzielone w buforze na kapilarę pod polem elektrycznym. Separacja opiera się na różnicach w elektroforetycznej ruchliwości peptydów. CE można sprzężyć z różnymi metodami wykrywania, takimi jak absorpcja UV, fluorescencja i spektrometria masowa, w celu poprawy dokładności identyfikacji i oczyszczania peptydu.
Inne rozważania
Rozpuszczalność
Rozpuszczalność peptydu jest ważnym czynnikiem w procesie oczyszczania. Jeśli peptyd ma słabą rozpuszczalność w rozpuszczalnikach oczyszczania, może prowadzić do wytrącania podczas oczyszczania, co wpłynie na odzyskiwanie i czystość peptydu. Aby poprawić rozpuszczalność peptydów, możemy dostosować pH rozpuszczalnika, dodać rozpuszczalniki lub użyć określonych środków solubilizujących.
Analiza czystości
Po dalszym oczyszczeniu kluczowe jest przeanalizowanie czystości peptydu. Wspólne metody analizy czystości obejmują wysoką wydajność chromatografię cieczową (HPLC), spektrometrię masową (MS) i rezonans magnetyczny jądrowy (NMR). HPLC może dostarczyć informacji o czystości chromatograficznej peptydu, podczas gdy MS może potwierdzić masę cząsteczkową peptydu i wykryć wszelkie zanieczyszczenia różnymi masami. NMR może być stosowany do określenia struktury i czystości peptydu na poziomie atomowym.
Wniosek
Jako dostawca peptydów katalogowych jesteśmy zaangażowani w zapewnianie naszym klientom wysokiej jakości peptydów. Gdy potrzebne jest dalsze oczyszczanie peptydów katalogowych, mamy do dyspozycji różne metody, w tym metody chromatograficzne, metody elektroforetyczne i inne rozważania, takie jak rozpuszczalność i analiza czystości. Starannie wybierając odpowiednią metodę oczyszczania i optymalizując warunki oczyszczania, możemy upewnić się, że peptydy spełniają wymagania naszych klientów o wysokiej czystości.
Jeśli masz jakieś potrzeby dotyczące peptydów katalogowych lub potrzebujesz dalszych usług oczyszczania, skontaktuj się z nami w celu uzyskania zamówień i dyskusji. Z niecierpliwością czekamy na współpracę z Tobą w celu zaspokojenia twoich badań i rozwoju peptydów.
Odniesienia
- Snyder, LR, Kirkland, JJ, i Dolan, JW (2010). Wprowadzenie do współczesnej chromatografii cieczowej. Wiley.
- Jorgenson, JW i Lukacs, KD (1981). Elektroforeza strefy kapilarnej. Chemia analityczna, 53 (8), 1298 - 1302.
- Laemmli, Wielka Brytania (1970). Rozszczepienie białek strukturalnych podczas montażu głowy bakteriofaga T4. Nature, 227 (5259), 680 - 685.