Systemina jest dobrze znanym roślinnym hormonem peptydowym, który odgrywa kluczową rolę w odpowiedzi obronnej rośliny przed roślinożercami i patogenami. Jako wiodący dostawca Systemin, zrozumienie sposobu wykrywania Systemin w roślinach ma ogromne znaczenie nie tylko dla badań naukowych, ale także dla zapewnienia jakości i autentyczności oferowanych przez nas produktów Systemin. Na tym blogu omówimy różne metody wykrywania Systeminy w roślinach, zagłębiając się w zasady naukowe stojące za każdym podejściem.
1. Immunologiczne metody wykrywania
Immunologiczne techniki wykrywania są szeroko stosowane do wykrywania systeminy w roślinach ze względu na ich wysoką specyficzność i czułość. Metody te opierają się na zastosowaniu przeciwciał, które specyficznie rozpoznają i wiążą się z Systeminem.
Enzym - połączony test immunoenzymatyczny (ELISA)
ELISA jest powszechnie stosowaną metodą immunologiczną. Polega na pokryciu mikropłytki przeciwciałem specyficznym dla Systemin. Następnie do studzienek mikropłytki dodaje się ekstrakty roślinne. Jeśli w ekstrakcie obecna jest Systemina, zwiąże się ona z unieruchomionym przeciwciałem. Następnie dodaje się drugie przeciwciało skoniugowane z enzymem. To przeciwciało drugorzędowe wiąże się również z Systeminą. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych substancji dodaje się substrat dla enzymu. Reakcja enzym-substrat wytwarza wykrywalny sygnał, często zmianę koloru, którą można zmierzyć fotometrycznie. Intensywność sygnału jest proporcjonalna do ilości Systeminy w próbce.
Do zalet testu ELISA należy jego wysoka czułość, możliwość jednoczesnego przetwarzania wielu próbek i względna łatwość użycia. Wymaga to jednak wytwarzania wysokiej jakości przeciwciał, a czasami problemem może być reaktywność krzyżowa z innymi peptydami zawartymi w ekstrakcie roślinnym.
Western Blot
Western blot to kolejna potężna technika immunologiczna. Najpierw ekstrahuje się białka roślinne i rozdziela za pomocą elektroforezy żelowej na podstawie ich masy cząsteczkowej. Oddzielone białka są następnie przenoszone na membranę. Przeciwciało specyficzne dla Systemin inkubuje się z membraną. Po przemyciu dodaje się przeciwciało drugorzędowe skoniugowane z odczynnikiem wykrywającym (takim jak marker fluorescencyjny lub chemiluminescencyjny). Obecność Systeminy jest wizualizowana jako wyraźny prążek na membranie.
Western blot pozwala na określenie masy cząsteczkowej Systeminy i może dostarczyć informacji o jej możliwych modyfikacjach. Jest jednak bardziej czasochłonna i wymagająca technicznie w porównaniu do testu ELISA.
2. Spektrometria mas - detekcja oparta
Spektrometria mas (MS) to bardzo dokładna i wszechstronna metoda wykrywania Systeminy w roślinach. Może identyfikować i oznaczać ilościowo peptydy na podstawie ich stosunku masy do ładunku (m/z).
Chromatografia cieczowa - spektrometria mas (LC - MS)
W LC - MS ekstrakty roślinne są najpierw rozdzielane za pomocą chromatografii cieczowej. Oddzielone składniki wprowadza się następnie do spektrometru mas. Spektrometr mas jonizuje cząsteczki i mierzy ich wartości m/z. Porównując uzyskane wartości m/z z teoretycznymi m/z Systeminy, można potwierdzić obecność Systeminy.
LC - MS oferuje wysoką rozdzielczość i możliwość wykrywania Systeminy nawet w złożonych matrycach roślinnych. Może również dostarczyć informacji o strukturze i możliwych modyfikacjach potranslacyjnych Systemina. Wymaga to jednak drogiego sprzętu i wysoko wykwalifikowanego personelu.
Tandemowa spektrometria mas (MS/MS)
MS/MS jest rozszerzeniem spektrometrii mas. Po wstępnej analizie mas w pierwszym spektrometrze mas wybrane jony poddaje się fragmentacji, a fragmenty analizuje się w drugim spektrometrze mas. Pozwala to na określenie sekwencji aminokwasów Systeminy, co jest niezbędne do potwierdzenia jej tożsamości.
MS/MS jest szczególnie przydatny w przypadku próbek, w których mogą występować peptydy izobaryczne lub izomeryczne, które mogą zakłócać identyfikację. Dostarcza szczegółowych informacji strukturalnych o Systeminie, ale jest również bardziej złożona i czasochłonna niż jednoetapowa spektrometria mas.
3. Biologia molekularna - wykrywanie oparte
Do wykrywania Systeminy na poziomie ekspresji genów można również zastosować techniki biologii molekularnej.
Odwrotna transkrypcja – reakcja łańcuchowa polimerazy (RT – PCR)
RT - PCR służy do wykrywania mRNA kodującego Systeminę. Najpierw z tkanek roślinnych ekstrahuje się całkowity RNA. Następnie mRNA ulega odwrotnej transkrypcji na komplementarny DNA (cDNA) przy użyciu odwrotnej transkryptazy. Specyficzne startery dla genu Systeminy stosuje się do amplifikacji cDNA metodą PCR. Amplifikowane fragmenty DNA można uwidocznić metodą elektroforezy żelowej.
RT - PCR pozwala na wykrycie ekspresji genu Systeminy, który może wskazywać stan fizjologiczny rośliny pod kątem jej reakcji obronnej. Dostarcza jednak jedynie informacji o potencjalnej produkcji Systeminy na poziomie transkrypcji i nie mierzy bezpośrednio obecności samego peptydu.
Ilościowa PCR w czasie rzeczywistym (qRT - PCR)
qRT - PCR to bardziej zaawansowana wersja RT - PCR. Pozwala na ilościowe określenie ilości mRNA Systemin w próbce. Podczas reakcji PCR do monitorowania amplifikacji w czasie rzeczywistym stosuje się barwnik fluorescencyjny lub sondę znakowaną fluorescencyjnie. Cykl, w którym sygnał fluorescencji przekracza próg (wartość Ct), jest odwrotnie proporcjonalny do ilości docelowego mRNA.
qRT - PCR zapewnia dokładniejszą ocenę ilościową ekspresji genu Systemin w porównaniu z tradycyjnym RT - PCR. Jest przydatny do badania regulacji produkcji Systeminy w odpowiedzi na różne bodźce.
4. Test biologiczny – wykrywanie na podstawie
Testy biologiczne opierają się na aktywności biologicznej Systeminy w celu wykrycia jej obecności. Wiadomo na przykład, że Systemina indukuje syntezę inhibitorów proteaz w roślinach. Test biologiczny można przeprowadzić, poddając tkankę roślinną próbce podejrzanej o zawartość Systeminy, a następnie mierząc indukcję inhibitorów proteazy.
Zaletą testów biologicznych jest to, że bezpośrednio mierzą aktywność biologiczną Systemin. Są one jednak mniej specyficzne w porównaniu z innymi metodami i mogą na nie wpływać inne czynniki zawarte w ekstrakcie roślinnym, które również mogą wpływać na syntezę inhibitorów proteaz.
Wniosek
Jako dostawca Systemin rozumiemy znaczenie dokładnego i niezawodnego wykrywania Systemin. Każda z opisanych powyżej metod ma swoje zalety i ograniczenia. Metody immunologiczne są wysoce specyficzne i czułe, spektrometria mas dostarcza szczegółowych informacji strukturalnych, techniki biologii molekularnej dają wgląd w ekspresję genów, a testy biologiczne mierzą aktywność biologiczną. W praktyce można zastosować kombinację tych metod, aby zapewnić dokładne wykrywanie i oznaczanie ilościowe Systeminy w roślinach.
Jeśli jesteś zainteresowany zakupem wysokiej jakości Systemina do swoich badań lub innych zastosowań, zapraszamy do kontaktu w celu dalszych rozmów. Zależy nam na dostarczaniu Państwu najlepszych produktów i usług. Mogą Cię również zainteresować niektóre z naszych innych produktów peptydowych, takich jakFragment glikoproteiny IIb (296 - 306),PHM - 27 (człowiek), ISekretyna (szczur).
Referencje
- Ryan, Kalifornia (2000). Szlak sygnalizacji systemowej: zróżnicowana aktywacja genów obronnych roślin. Biochimie, 82(10–11), 847–853.
- Schilmiller, AL i Howe, Georgia (2005). Systemina: sygnał polipeptydowy dla reakcji obronnych roślin. Aktualna biologia, 15(18), R744 - R747.
- van der Hoorn, RA i Jones, JD (2004). Proteazy w obronie przed patogenami. Aktualna opinia w biologii roślin, 7(4), 400 - 406.